Rola wariantów receptorów DP prostanoidu pod względem podatności na astmę ad

Ta liczba podmiotów pozwoliła nam wykryć warianty, które miały częstość przekraczającą 5 procent. Rodowite pochodzenie zostało ustalone na podstawie autoportretu, a wszystkie podmioty wyraziły pisemną świadomą zgodę. Genomowy DNA do sekwencjonowania został wyekstrahowany z limfocytów unieśmiertelnionych przy użyciu protokołu opartego na wirusie Epsteina-Barra i przygotowany jak opisano wcześniej.13 Tabela 1. Tabela 1. Charakterystyka demograficzna dwóch badanych populacji. Do genotypowania wykorzystano genomowy DNA przygotowany z świeżej krwi pełnej pobranej od 518 białych i 80 czarnych pacjentów z łagodną do umiarkowanej astmą na podstawie kryteriów spirometrycznych14 oraz od 175 białych i 45 czarnych kontrolnych bez historii astmy, atopii lub klinicznie choroba. Biali i czarni pacjenci byli rekrutowani z 20 amerykańskich ośrodków na próbę leczenia 15; dobrane pod względem rasowym zdrowe kontrole zostały rekrutowane z populacji armii USA16 (tabela 1).
Identyfikacja wariantów sekwencji
Genomowy DNA przeszukiwano pod kątem mutacji w kodowaniu białkowym i regionach 5 -flankujących PTGDR przez konformacyjną analizę polimorfizmu pojedynczej nici13 z użyciem starterów oligonukleotydowych zaprojektowanych z sekwencji nukleotydowej GenBank (numer dostępu AC012407). Produkty reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), których ruchliwość elektroforetyczna różniła się od sekwencji konsensusowej, zostały ponownie amplifikowane, a produkty zostały zsekwencjonowane. Warianty sekwencji promotorowej i eksonu zidentyfikowano za pomocą automatycznego sekwencjonowania DNA z 50 unikalnych chromosomów, a sekwencję 30 unikalnych chromosomów określono dla eksonu 2.
Transient Transfection Analysis with Promotor Reporter Constructs
Konstrukty reporterowe PTGDR o 1102 bp wytworzono za pomocą amplifikacji PCR genomowego DNA od osobników homozygotycznych, którzy mieli alternatywne haplotypy z użyciem starterów, które zawierały miejsca rozpoznawane przez KpnI i XhoI. Amplicony klonowano i ligowano do wektora lucyferazy świetlika i namnażano zgodnie ze standardowymi technikami. Plazmidowe DNA oczyszczono za pomocą układu oczyszczania plazmidu Qiagen.
Efekty konstruktów (1,5 .g) zawierających haplotypowe warianty PTGDR badano w przejściowo transfekowanych komórkach A549, hodowano do 80 procentowego zlewania w sześciostudzienkowych płytkach i kotransfekowano 75 ng wektora lucyferazy renilla przy użyciu Lipofectamine PLUS i odczynnika Lipofectamine ( Invitrogen). Transfekowane komórki inkubowano przez 24 godziny, a następnie umieszczono w pasywnym buforze do lizy. Aktywność lysatu świetlika i lucyferazy renilla badano za pomocą systemu do analizy reporterowej Dual-Lucyferaza (Promega). Aktywność lucyferazy świetlika została skorygowana o aktywność lucyferazy renilla w celu kontroli różnic w skuteczności transfekcji.
Konstrukcje ekspresji transkrypcji
Komórki A549 przejściowo transfekowano 500 ng wektora ekspresyjnego . (C / EBP.) wiążącego białko wiążące CCAAT / wzmacniacz (dostarczone przez Dr. S. Akirę i Dr. M. Hoshino, Uniwersytet Osaka, Osaka, Japonia) lub 100 ng wektor ekspresyjny GATA-3 (uprzejmie dostarczony przez Dr. LC Ho, Harvard School of Public Health, Boston), 1,5 .g wektora lucyferazy świetlika z wariantem haplotypowym CCT PTGDR i 500 ng wektora .-galaktozydazy, jak opisano uprzednio. Komórki Schneider S2 hodowane w sześciostudzienkowych płytkach z pożywką droofila-SFM (Invitrogen) przejściowo transfekowano 500 ng wektora ekspresyjnego Sp1 (pPACUSP1, udostępnionego przez lekarza
[więcej w: grzybica skóry zdjęcia, jagody goji opinie, gościec stawowy ]
[patrz też: guzki schmorla, sita nowy sącz, piotr jacoń ]